Test Hipoosmótico en el Caballo

Autor: Jorge Fontanillas
EQUISAN Veterinaria Equina Integral

Introducción

Con la implementación de la inseminación artificial y otras técnicas de reproducción asistida, el almacenamiento de espermatozoides se ha convertido en un procedimiento de gran importancia para la obtención de embriones y para las técnicas de fertilización in Vitro.

La aceptación del semen congelado por importantes asociaciones equinas como la Asociación de Caballos Árabes, la Asociación de Caballos Cuarto de Milla, la Asociación de Caballo Pinto Americano y la Asociación Nacional de Criaderos de Caballos Pura Raza Española entre otras, han estimulado la investigación de protocolos para criopreservar el semen equino. Sin embargo, se ha estimado que solo el 30-40% de los caballos producen semen apto para la criopreservación y se ha observado una marcada variación en la congelación de espermatozoides entre criaderos, lo que dificulta la amplia aplicación del uso del semen congelado y refrigerado por la industria equina. Por tanto, se prevé, que la industria equina utilizará semen refrigerado y congelado solo cuando la fertilidad del mismo sea demostrada.

Para evaluar la resistencia del semen equino a estos cambios de temperatura se han incluido diferentes parámetros como la motilidad, viabilidad y morfología entre otros. Pero estos parámetros son deficientes para determinar valores predictivos de funcionalidad y fertilidad del semen. Debido a esto, se han diseñado metodologías que permitan una evaluación más funcional y ágil que complementen los parámetros utilizados en nuestro medio.
A pesar del esfuerzo de muchos investigadores por mejorar las técnicas de refrigeración equina, la pérdida de viabilidad en el espermatozoide equino después de la refrigeración continúa siendo un limitante para el amplio uso de esta técnica. Uno de los tipos de daños frecuentemente encontrado en semen descongelado es la pérdida de integridad de la membrana plasmática, directamente relacionada con su supervivencia y su capacidad fecundante.
Los métodos a los que son sometidos los espermatozoides como el  lavado, centrifugación, refrigeración y congelación pueden generar, directa o indirectamente, daños irreversibles que disminuyan su funcionalidad.

La aparición de estos daños a los espermatozoides, incluidos a los de sementales de gran valor genético y económico, hace necesaria la implementación de pruebas que permitan determinar la fertilidad del semen y seleccionar los mejores ejemplares para la cría. Además, se ha reportado que las centrifugaciones y la criopreservación inducen una liberación significativa de especies reactivas de oxígeno (ERO) que afectan la estabilidad de la membrana, la integridad de los receptores de membrana y el ADN nuclear en el espermatozoide, resultando en una disfunción espermática que puede traer efectos negativos en la unión oocito-esperma.
Como  se mencionó anteriormente, con todos estos procesos queda comprometida de manera irreversible la membrana del espermatozoide por lo cual se hace necesario valorar la funcionalidad de la misma. Debido a esto, se han diseñado metodologías que permitan una evaluación más funcional y ágil, que complementen los parámetros espermáticos utilizados en nuestro medio. Una de estas técnicas es el test hipoosmótico (HOS test), que permite evaluar la funcionalidad de la membrana espermática al sufrir  un hinchamiento (swelling), después de ser sometida a una solución hipoosmótica.

Los parámetros estandarizados usados para evaluar la infertilidad del macho (número total, movilidad progresiva y morfología) tienen una capacidad limitada para predecir el potencial fecundante de un eyaculado. La membrana espermática es de fundamental importancia en el proceso de fertilización, por esa razón se ha dedicado bastante atención a esta área de estudio en los últimos años. Existen tres pruebas que están disponibles para avaluar la integridad de la membrana, entre ellos encontramos tinciones supravitales,  TBA (tiobarbituric acid assay) y el test hipoosmótico.

La coloración supravital realizada con eosina amarillada 2% (Krause, 1966), determina de forma objetiva las células viables para determinar la integridad de la membrana espermática. Cuando las células sufren una lesión de la membrana absorben el colorante, por tanto, los espermatozoides no coloreados representan a las células viables y los coloreados a las células muertas. Sin embargo, la fertilización no ocurre si la membrana espermática está bioquímicamente inactiva, inclusive si el espermatozoide está estructuralmente intacto, por lo que el test hipoosmótico es un indicador más apropiado que la tinción supravital para evaluar membranas.

La capacidad de los espermatozoides equinos para revertir el efecto de la hinchazón producido por el test hipoosmótico es probable que se suceda durante el proceso de criopreservación posterior.

Una vez visto el importante papel que juega la membrana espermática en la capacidad fecundante de un eyaculado, sería interesante el estudio de la estructura y composición de dicha membrana.

Membrana plasmática del espermatozoide

Todo el espermatozoide está contenido en la membrana plasmática, que se ensancha en áreas especializadas y forma el componente más externo del espermatozoide. Permanece intacta, excepto en la región del acrosoma previo a la fertilización o como resultado de la muerte del espermatozoide (Davies, 1999).

La membrana plasmática del espermatozoide es heterogénea y tiene cinco dominios específicos: el acrosoma, segmento ecuatorial, basal, pieza media y cola (Aurich, 2005). La composición lipídica y proteica de cada membrana es única y ocurre muy poco o nada de intercambio de lípidos o proteínas entre ellas.
Estructuralmente se compone de tres capas o zonas: bicapa lipídica, interfase fosfolípidos-agua y glycocalix.

La bicapa lipídica esta subdividida en fosfolípidos polares, que se orientan con las cabezas polares hidrofílicas situadas externamente y las cadenas de ácidos grasos orientadas internamente. La mayoría de los lípidos son fosfolípidos y colesterol. La cantidad de colesterol, relativo al fosfolípido, determina la fluidez de la membrana y guarda una relación indirecta. El colesterol, actúa junto con proteínas integrales, como un estabilizador asegurando una configuración laminar de los fosfolípidos y de la bicapa. Es sabido que la concentración de colesterol varía entre las zonas de la membrana plasmática, siendo más alta en la región del acrosoma (Davies, 1999).
Todos los lípidos pasan por una fase de transición, desde un estado fluido o líquido-cristalino, (cadenas desordenadas), a un estado de gel, (cadenas de ácidos grasos que están cada vez más rígidas y paralelas) a medida que la temperatura disminuye. Para una apropiada función se requiere que la membrana se encuentre en estado fluido.

La temperatura de transición para fosfolípidos en potros es 20,7° C, comparado con 24°C, 25,4° C y 24,5° C en verraco, toro y gallo respectivamente. De modo similar el potro mostró la temperatura de transición más bajo a los 33,4° C, comparado con 36,2° C y 42,8° C para verraco y toro.

Es posible que estas diferencias reflejen las distintas tolerancias de los espermatozoides a las rápidas disminuciones de temperatura en procesos de criopreservación.

Las proteínas se encuentran también entre los lípidos y hacen hasta un 50% del peso de la membrana plasmática. Estas proteínas actúan como proteínas estructurales (integrales) y como puntos de unión para otras proteínas periféricas. Las estructurales pueden también actuar como canales o poros a través de los cuales pequeñas moléculas pueden pasar al citoplasma de los espermatozoides.
La siguiente área es la interfase agua-fosfolípido, que es la unión entre los grupos de cabezas polares hidrofilicas de la capa lipídica y el medio circundante (principalmente agua) y en el cual se encuentra el glycocalix.
El glycocalix es una capa externa de polisacáridos del espermatozoide equino. Su función exacta no es clara, pero se piensa que está involucrado en antigenicidad, adherencia celular y permeabilidad específica. Es sabido que dentro del glycocalix existen uniones para proteínas periféricas. Estas proteínas son provenientes del plasma seminal y actúan estabilizando al espermatozoide durante su paso por el tracto masculino y femenino. También pueden estar involucradas en la capacitación (Davies, 1999).

Test hipoosmótico (HOS test)

La membrana espermática es fundamental para el proceso de fertilización y es por ello que se ha dado más importancia a esta área de estudio en las últimas décadas. El test hipoosmótico, que fue desarrollado para semen humano (Jeyendran et al., 1984) ha sido adaptado con éxito en varias especies como el bovino (Correa y Zavos, 1994; Rota et al., 2000), el equino (Neild et al., 1999 y 2000; Nie, 2000), el porcino (Tamuli y Watson, 1992; Vázquez y col., 1997), el carnero (Fukui et al., 2004), el macho cabrío (Fonseca et al., 2005), el perro (Kumi-Diaka, 1993; Pinto y Kozink, 2007), el búfalo (Lodhi et al., 2008) y los camélidos sudamericanos (Giuliano et al., 2003).

La prueba hipoosmótica evalúa si la membrana espermática es funcional y para ello se basa en la capacidad de los espermatozoides de funcionar como osmómetros. Como tales, si se los coloca en un medio hipoosmótico, los espermatozoides bioquímicamente activos incorporan agua de forma activa en el citosol. Los espermatozoides que possen una membrana plasmática funcional presentan “swelling” o endósmosis (cambios morfológicos en la cola típicas del engrosamiento sufrido asociado con la inflamación citosólica al incorporar agua) porque mantienen la capacidad de incorporar agua para equilibrase con el medio que los rodea. Una solución hipoosmótica optima debería ejercer un estrés osmótico suficiente como para aumentar el volumen celular de forma observable pero sin provocar la lisis de la membrana espermática.

Material y métodos

En un vial, se adiciona 1mL de la solución hipoosmótica [100 mOsmol/L] compuesta por fructosa y citrato de sodio preparado en agua bidestilada, y se mezcla con 1,1mL del botón que se  obtiene del lavado de los espermatozoides. Esta solución (mezcla) se incuba a 37ºC por un tiempo de media hora.

Para medir hinchamiento espermático, se coloca una gota de la mezcla sobre un portaobjetos y se tapa con un cubreobjetos para observar bajo microscopio óptico o con microscopio de contraste de fase a 400x (utilizando el objetivo de 40x). La proporción total y los diferentes patrones de hinchamiento se calculan dividiendo el número de células reaccionadas por 100 sobre el total de espermatozoides contados en la muestra.

Patrones observables, semen fresco y semen congelado

SS: Espermatozoides sin swelling (membrana citoplasmática dañada).
A-F: Espermatozoides con swelling (membrana citoplasmática funcional). (Semen fresco).

SS: Espermatozoides sin swelling (membrana citoplasmática dañada).
A-F: Espermatozoides con swelling (membrana citoplasmática funcional). (Semen congelado).

Resultados

Una vez calculado el porcentaje, un 50-60% es un resultado óptimo que se podría traducir en un 80% de preñez. Por el contrario, <40% es un resultado dudoso en el que se necesitarían varias inseminaciones para conseguir preñez.
Los resultados en el test hipoosmótico tienen una elevada correlación, siendo un indicativo fiable de la predicción de preñez en contraposición a los estudios clásicos de morfología o movilidad progresiva.

Conclusiones

El test hipoosmótico es una herramienta muy útil y se debería introducir en las evaluaciones de rutina como parámetro funcional de la capacidad fecundante de un semental.
Tiene la ventaja de ser menos susceptible a los efectos inmediatos del shock térmico por frío y de evaluar espermatozoides individuales, a diferencia de la evaluación clásica de la movilidad progresiva, que hace una evaluación más subjetiva de la población como un todo.
Sin embargo, hay que tener cierta experiencia en la interpretación, ya que un aumento del porcentaje de espermatozoides con la cola doblada antes de someterlos al medio hipoosmótico puede inducir a errores y  malas interpretaciones.

Referencias

- Natalia Giraldo S. , Juan Esteban Correa Villegas, Neil Vasquez Araque. Revista CES /medicina veterinaria y zootecnia / Volumen 2 / Número 2 / 2006: Evaluación del efecto de la refrigeración sobre la calidad del semen equino.

- Gustavo A. Palma. Biotecnología de la reproducción. 2001.

- Neild D, Miragaya MH. Test hipoosmótico en espermatozoides equinos.

- Dra. María Teresa Wunder Giglio. Membrana plasmática del espermatozoide.

- Harald Sieme. Techniques for evaluating semen quality of stallions. 2008.

- Dickson D. Varner. Technological Advancements in Semen Evaluation of Stallions. Proceedings of the 11th International Congress of the World Equine Veterinary Association 2009.